Подбор режима минерализации — самая важна задача для анализа белка методом Кьельдаля.
У нас есть другая статья, где приведен самый универсальный режим минерализации, но он является overkill методом, т.е. не самый эффективный по времени и ресурсам. Плюс все равно он не гарантирует наилучшие результаты из возможных.
Для того, чтобы подобрать наилучший режим, надо решить следующие задачи:
- температурный режим
- количество добавляемой пробы
- выбор катализаторов
- объем добавляемой кислоты
Температурный режим стоит начать с универсального over kill режима, приведенного в нашей другой статье. Далее стоит уменьшать жесткость режима, наблюдая за тем, чтобы значение получаемого азота после титрования НЕ УМЕНЬШАЛОСЬ. Если увеличивается — это как правило хорошо. Ну и очевидно, минерализованная проба должна оставаться прозрачной, без желтого или коричневого оттенка. Проба может быть прозрачной, белой, зеленой, синей, НО НЕ КОРИЧНЕВЫХ ОТТЕНКОВ. Если проба имеет оттенки коричневого — значит даже матрица пробы не сгорает, не говоря уже о степени высвобождения азота.
В выборе количества добавляемой пробы и соответственно кислоты следует руководствоваться:
- концентрацией азота в пробе;
- количеством веществ в мешающей матрице.
Ожидаемая концентрация азота в пробе должна быть таковой, чтобы на ее титрование желательно уходило не менее 5 мл 0,1Н соляной кислоты (желательно 10-15 мл). Это обеспечит высокую точность.
Количество веществ в матрице влияет на количество серной кислоты. На изображении ниже видно сколько надо серной кислоты, чтобы разложить по 1 г разных групп веществ:
Поэтому пробы тем больше, чем меньше в ней азота или она более разбавлена. Пробы тем меньше, чем больше в ней мешающей матрицы. Кислоты добавляется тем больше, чем итоговая масса пробы и больше в ней жиров.
Выбор катализаторов следует начинать с любого из KjelReference Missouri, но для более точного подбора, у нас есть отдельная статья, посвященная выбору катализаторов. Примерно на каждые 10 мл серной кислоты идет до 4 г катализаторов. На 15 мл — обычно 5-6 г катализатора. Больше катализатора добавлять не надо, в данном случае больше — не значит лучше.
Как проверить, что режим наиболее подходящий?
Самый лучший способ — измерить сертифицированный стандартный образец (ССО) массовой доли азота и сравнить с значением из сертификата. Очень важно, чтобы ССО был той же матрицы, что и ваша проба. Также вы должны доверять производителю данного ССО. Метод, по которому производитель ССО установил сертифицированное значение массовой доли азота НЕ МОЖЕТ быть по той же методике (ГОСТу), что и вы используете. Должен быть какой-то более точный или более хитрый метод.
Второй хороший вариант — межлабораторные сличения с пробой, имеющей вашу матрицу. Он не так хорош, как первый вариант, но также может быть достаточно показателен, если среди лабораторий, участвующих в межлабораторных сличениях, нет сговора.
Если первых два недоступно, то можно использовать метод «больше-меньше». Логика его заключается в том, что СРЕДНЕЕ значение азота будет тем выше, чем лучше минерализация и высвобождение вещества. В данном случае, вам следует использовать один и тот же метод дистилляции (например, указанный в нашем over kill методе) и много ОЧЕНЬ ХОРОШО ГОМОГЕНИЗИРОВАННОЙ одной и той же пробы для всех параллельных серий измерений. Необходимо для каждого тестового измененного режима минерализации загружать весь минерализатор по 8-20 (смотря какой у вас минерализатор) пробирок одновременно и высчитывать среднее (именно среднее) между всеми пробирками. Судить о больше / меньше следует СТАТИСТИЧЕСКИ — с учетом стандартного отклонения средних, рассчитанного между всеми пробирками.
Использовать чистые вещества аминокислоты (типа Триптофана) с добавлением сахарозы как нагрузки — не очень хорошие метод, т.к. он матрица очень мягка и легко разлагается, а триптофан — это отдельная аминокислота, т.е. уже гидролизованный белок, а также не связан в структуре матрицы. Подобранный режим на такой пробе не гарантирует уровень минерализации.
